Sind Proteintröpfchen in der Zelle wirklich Kondensate?

Tests für Flüssig-Flüssig-Phasentrennung bei der Zellteilung sind wenig verlässlich

Kompartimente in Zellen wie Mitochondrien sind räumlich durch Membranen getrennt. Andere, wie die Nukleoli, haben überhaupt keine Membran. Wie diese membranlosen Kompartimente entstehen, ist noch immer eines der größten Rätsel der Biologie. In den letzten Jahren wurde ein Phänomen namens Flüssig-Flüssig-Phasentrennung als treibende Kraft für die Kompartimentbildung vorgeschlagen. Die Gruppe um Andrea Musacchio, Direktor am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, hat nun eine Validierungsstrategie entwickelt, um die Rolle der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung bei der Kompartimentbildung und gängige Methoden zum Nachweis von ihrer Eigenschaften zu bewerten. Mit dieser Strategie konnten die Forschenden zeigen, dass der bekannte Flüssig-Flüssig-Phasentrennungstreiber, der chromosomale Passagierkomplex, der den Prozess der Zentromerbildung steuern soll, keine Flüssig-Flüssig-Phasentrennungseigenschaften hat und die Tests nur eine schwache Vorhersagekraft haben. Diese neue Strategie könnte ein wichtiges Instrument zur Validierung der Rolle anderer potenzieller Flüssig-Flüssig-Phasentrennungstreiber werden, die bisher identifiziert wurden.

Proteine erfüllen die meisten Funktionen in unserem Körper durch die Interaktion mit anderen Proteinen. Dabei stehen sie jedoch vor einem Dilemma - sie bewegen sich in der Zelle mit 40 Millionen potenziellen Interaktionspartnern. Den richtigen Partner zu finden, kann daher der Suche nach einer Nadel im Heuhaufen gleichen. Doch die Zelle hat eine Strategie gefunden, die Wahrscheinlichkeit deutlich zu erhöhen, dass ein Protein zufällig den richtigen Partner zur richtigen Zeit trifft. So wie sich zwei Menschen am Arbeitsplatz, im Café oder im Club begegnen, leiten räumliche Hinweise Proteine zu bestimmten Zellkompartimenten, wie der Plasmamembran oder dem Mitochondrium.

Der Prozess der Zellteilung beispielsweise wird durch Signalprozesse an der Zellmembran eingeleitet, die Enzyme aktivieren, deren Signale schließlich im Zellkern gezielt Gene einschalten. Bei der anschließenden Zellteilung führt eine Vielzahl spezifischer Proteininteraktionen zur Bildung eines vielschichtigen Proteinkomplexes an den Zentromeren der Chromosomen, der die fehlerfreie Verteilung der Chromosomen einer Mutterzelle auf ihre beiden Töchter gewährleistet.

Die Natur hat eine bestimmte Chemie für interagierende Proteine entwickelt: Proteine, die füreinander bestimmt sind, verfügen über evolutionär konservierte und exponierte Grenzflächen mit detaillierten chemischen Identitäten in ihrer 3D-Struktur, die zueinander passen. Diese Motive finden sich artübergreifend und ermöglichen hochspezifische Proteininteraktionen.

Ein Paradigmenwechsel?

Um die Jahrhundertwende wurden erstmals zelluläre Kompartimente beobachtet, die nicht durch physische Grenzen abgegrenzt sind. Heute wissen wir, dass Nukleoli, P-Körperchen oder Stressgranula Makromoleküle, hauptsächlich Proteine und RNA, konzentrieren und wichtige Funktionen in der Zelle haben. Die Entdeckung dieser membranlosen Kompartimente hat ein neues Forschungsgebiet voller unbeantworteter Fragen eröffnet. Wie diese Kompartimente gebildet werden und wie sie ihre Struktur beibehalten, ist dabei von größtem Interesse.

In den letzten Jahren hat die Idee, dass sich diese Kompartimente durch eine Entmischung von zwei flüssigen Phasen (Flüssig-Flüssig-Phasentrennung) bilden, stark an Bedeutung gewonnen: Ein Prozess vergleichbar mit der spontanen Bildung von Öltröpfchen in Wasser. Nach dieser Annahme sind membranlose Kompartimente "Kondensate", deren Bildung auf vorübergehende, schwache und unspezifische Wechselwirkungen von "Treiber"-Proteinen beruht. So reichern sich diese Proteine in höherer Konzentration als im umgebenden Medium an. Mit Hilfe von Tests, die die Phasentrennungseigenschaften von Proteinen außerhalb der Zelle untersuchen, konnten bisher Dutzende dieser Treiber identifiziert werden, darunter auch der chromosomale Passagierkomplex. Von ihm wird behauptet, dass es Kondensate am Zentromer bildet, um dessen Organisation und Funktion während der Mitose zu modulieren.

In vitro ist nicht in vivo

"Für viele Forschende ist die Phasentrennung zur Standarderklärung für die Bildung von membranlosen Kompartimenten geworden. Es gibt jedoch kaum Belege dafür, dass in vitro durchgeführte Flüssig-Flüssig-Phasentrennungstests wirklich einen physiologischen Prozess in der Zellumgebung vorhersagen können", sagt Musacchio. Zusammen mit seinem Team hat er eine Strategie entwickelt, um einen weit verbreiteten Test und seine Vorhersagekraft zu bewerten, und diese auf den chromosomale Passagierkomplex angewendet. "Unserer Meinung nach besteht eine große Schwäche des Tests darin, dass er das Lösungsmittel nicht mit ausreichender Genauigkeit modelliert. Das Lösungsmittel bestimmt die Löslichkeit eines Proteins und damit seine Fähigkeit, mit anderen Proteinen zu interagieren".

Um die natürliche Umgebung der Zelle so genau wie möglich nachzubilden, fügten die Forschenden verdünnte Lysate von Bakterien- oder Säugetierzellen zu Standard-Flüssig-Flüssig-Phasentrennungspuffern hinzu. Selbst bei stark verdünnten Konzentrationen verhinderten die Lysate die Bildung von Kondensaten vollständig. Um auf Nummer sicher zu gehen, wiederholten die Forschenden das gleiche Experiment mit mehreren zusätzlichen Proteinen, die alle im Standardtest Flüssig-Flüssig-Phasentrennungseigenschaften zeigten. Und tatsächlich: In allen Fällen löste die Zugabe von Zelllysaten die Kondensate auf. "Diese Ergebnisse bestätigen unsere Annahme, dass die zelluläre Umgebung die unspezifischen schwachen Wechselwirkungen, von denen man annimmt, dass sie die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung in vitro verursachen, wirksam puffert", sagt Musacchio.

Schlechte Vorhersagekraft

Die Interaktion und die Funktion von Proteinen in der Zelle werden stark durch sogenannte posttranslationale Modifikationen reguliert. Das gezielte Hinzufügen oder Entfernen von Phosphatgruppen an kritischen Stellen kann beispielsweise die Interaktion zwischen zwei Proteinen mit sofortiger Wirkung stören. Diese natürlichen Modifikationen können im Labor durch Mutationen imitiert werden. So werden viele natürliche Prozesse untersucht. Durch die Einführung von Mutationen an vier Resten, die an der Erkennung von phosphorylierten Stellen beteiligt sind, erzeugten die Forschenden eine Mutante des chromosomalen Passagierkomplexes , die nicht an Zentromeren rekrutiert werden kann und sich dort nicht anreichert. Dennoch zeigte diese Mutante im in-vitro-Assay das volle Flüssig-Flüssig-Phasentrennungspotenzial. Dies offenbart, dass der Assay nicht in der Lage ist, die Lokalisierung und Funktion des chromosomalen Passagierkomplexes vorherzusagen.

„Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung einer einzelnen Komponente in vitro keine Vorhersage über die Löslichkeit und Lokalisierung in der komplexen und überfüllten Umgebung der Zelle machen kann. Die Liste der mutmaßlichen Flüssig-Flüssig-Phasentrennungstreiber, die durch die etablierten Assays identifiziert wurden, muss umfassend überprüft werden, und die Validierungsstrategie, die wir hier vorstellen, kann diese Bemühungen anleiten", sagt Musacchio. „Für die Zukunft planen wir, unsere Experimente mit vielen der mutmaßlichen Treiber zu wiederholen, insbesondere mit denen, die sich zu Vorzeigeobjekten in der Entwicklung des Flüssig-Flüssig-Phasentrennungsfeldes entwickelt haben. Unsere Experimente zeigen, dass das Zytosol ein starkes Lösungsmittel ist, dessen Rolle nicht vernachlässigt werden darf. Daher wird es wichtig sein, geeignete zytomimetische Medien als Standards für die Bewertung biochemischer Reaktionen in vitro zu entwickeln. Wir werden versuchen, einen Beitrag zu diesem Forschungsbereich zu leisten.“